장벽 기능 연구

Barrier application
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우리 몸에는 조직 내외로 이동하는 물질로부터 조직을 보호하기 위한 세포 장벽이 존재하고 있으며 이러한 장벽은 기본적으로 상피세포와 내피세포로 구성되어 있습니다. 염증, 감염, 암 세포 전이, 백혈구 이동과 같은 생물학적 이벤트와 많은 일반적인 작용들(예: GPCR)에 의해 장벽 투과도는 달라질 수 있습니다.

Axion Biosystems 의 Maestro Z 플랫폼은 실시간으로 경상피 전기저항(TEER) 과 장벽 기능을 연구할 수 있도록 지원합니다. 연속 데이터 측정으로 시간과 비용 집약적인 기존 실험에 비해 장벽 투과 기능 변화에 대한 보다 온전한 이해를 돕습니다.

체외 장벽 모델 측정

경상피 전기저항(TEER) 은 세포 장벽 무결성을 측정하는 데 중요한 척도입니다. 수동으로 전극을 들고 수행해야 하는 경상피 전기저항(TEER) 측정 장치들은 전극 위치에 매우 영향을 많이 받으며 수동으로 전극을 다루는 과정에서 세포층이 파괴될 수 있습니다. 하지만 Maestro Z 의 통합형 전극 디자인은 이와 같은 어려움을 극복했습니다.

 

통합형 전극의 장점

  • 일관성
  • 재현성
  • 고효율
TEER Barrier Function Assay Workflow

장벽 기능 측정 실험

경상피 전기저항(TEER)
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경상피 전기저항(TEER)은 보통 장벽 투과도를 확인하기 위해 측정합니다.

 

Maestro Z  플랫폼은 경상피 전기저항(TEER)을 측정할 수 있으며 그로부터 장벽 기능을 수치화 할 수 있습니다. 다른 주파수 값의 변화를 연속적으로 측정함으로써 경상피 전기저항값을 표준화하여 장벽 기능값을 수치화 합니다. 이는 장벽 기능의 작고 일시적인 변화를 민감하게 측정할 수 있는 실험 기법입니다.

장벽 투과도 변화 실시간 모니터링
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장벽 투과도는 일반적으로 사용되는 많은 약물들이나 신호 전달 물질에 의해 변화될 수 있습니다.

TEER can be measured continuously.
Monolayers cultured for 14 days and treated with Ethanol which significantly reduced TEER

(A) 장벽 투과도는 세포가 증식하여 배양되는 동안에도 지속적으로 측정될 수 있습니다. (B) Calu-3 세포를 CytoView-Z 96well 플레이트에서 14일간 단층으로 배양하고 cytochalasin D 와 ethanol 을 처리하여 장벽 투과도의 변화를 확인했습니다.

 

Maestro Z를 통해 경상피 전기저항(TEER)을 지속적으로 모니터링 하고 세포가 적정 농도까지 증식한 것을 확인한 후에 cytochalasin D 혹은 ethanol 을 처리했습니다. ​

결과: Cytochalasin D 는 액틴의 연쇄사슬작용을 억제하여 밀착연접에서의 투과도를 증가시켰습니다. Ethanol 은 두가지 주요 밀착연접 단백질인 ZO-1 과 claudin-1 에 서서히 영향을 미쳤습니다. 눈에 띄게 감소한 경상피 전기저항과 장벽 기능 저하를 통해 두 물질이 서로 다르게 작용하였음을 확인했습니다. ​

세포 증식 정도에 따른 경상피 전기저항(TEER) 표준화
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목적: Maestro Z 를 통해 세포 증식 정도와 경상피 전기저항(TEER)를 지속적으로 측정할 수 있음을 증명하고자 합니다. 경상피 전기저항(TEER)은 세포 증식이 이뤄진 상태에서 측정하기 때문에 다양한 주파수 측정을 통해 Maestro Z 플랫폼은 경상피 전기저항(TEER) 값을 세포 증식도에 따라 표준화 할 수 있습니다. ​

 

TEER
TEER Coverage
Barrier Index

 

낮은 주파수 측정은 밀착연접에 의한 세포내의 장벽 형성 측정에 매우 민감하게 반응하며 세포 주위 장벽은 세포막에 의해 형성됩니다. ​

결과: Maestro Z 는 지속적으로 그리고 연속적으로 두 종류의 인간 폐 상피세포의 세포 증식을 모니터링하고 장벽 기능을 모니터링했습니다. 두 종류 모두 24시간 내로 충분히 증식했지만 밀착연접 단백질을 발현하는 Calu-3 세포의 경우 낮은 주파수의 경상피 전기저항(TEER) 신호가 측정되었고 이를 통해 강한 세포 장벽이 형성되었음을 확인했습니다.

Disease-in-a-dish 모델에서 장벽 기능 평가
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장벽이 적절하게 형성되는 것은 인간 신체에 있어 중요한 기능이며 낭성 섬유증과 같은 질병에 의해 손상되기도 합니다. Calu-3 는 세포간 밀착연접을 만들고 CFTR(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)를 발현하여 β-adrenergic 자극에 의한 이온의 세포막 이동이 가능한 불멸화 세포주입니다[Shen et al., 1994]. 따라서 경상피 전기저항(TEER) 측정으로 점액질 분비를 촉진하기 위한 이온 채널을 관장하는 CFTR 의 기능을 확인할 수 있습니다.

Addition of isproterenol significantly reduced TEER
Measurements cconfirming CFTR as the mechanism for action for the change in TEER

(A) Isoproterenol(100nM)과 Forskolin(10uM)의 처리는 Calu-3 세포의 경상피 전기저항(TEER) 을 현저히 감소시켰습니다. 그리고 농도에 따른 신속한 변화를 보기 위해 CFTR(inh)-172 를 각각 30 uM과 300uM을 처리했습니다. (B)CFTR(inh)-172를 처리하고 5분이 경과한 후에 각 농도에 따라 isoproterenol 과 forskolin 의 작용이 저해되었음을 확인할 수 있었습니다.

장내 미생물군집(마이크로바이옴)의 다양성 연구
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목적: 장 조직 내에 존재하는 장내 미생물군의 영향을 평가하고자 했습니다. 다이어트는 장내 미생물군의 구성에 영향을 주고 이는 과민성 장증후군(irritable bowel syndrome, IBS)을 유발하기도 합니다[Bootz-Maoz, et al., 2022].

Dynamic measurement of microbiome on gut tissue​

(Images from H Bootz-Maoz, A. Pearl et al, Cell Reports, 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111657 )

 

(장 세포와의 공동 배양을 통해 (위)두 명의 환자로부터 분리한 B. adolescentis 10종의 24시간 경과 후 장벽 인덱스 값과 (아래)시간 경과에 따라 B.adolescentis 와 B.fragilis에 의한 장벽 인덱스 값의 차이를 확인했습니다. ​

결과: B.adolescentis 는 장 세포의 장벽 기능을 저해한 반면 B.fragilis 는 장벽 기능에 영향을 주지 않았습니다.

 

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TEER Featured Video

Featured Content: Publication Spotlight Video​​

Axion’s Stacie Chvatal, PhD, discusses how the authors investigate colonic responses to microbiota communities in people with irritable bowel syndrome before and after a low-FODMAP diet using TEER.​

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